手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何正確選擇逆轉錄引物？

更新時間：2023-08-24 點擊次數：497

1. Oligo（dT）

Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重復寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈。因為Oligo(dT)與mRNA的Poly(A)尾巴可以發生特異性結合，所以用Oligo(dT)特異結合到mRNA上Poly(A)尾端，因此，主要用于逆轉帶有Poly(A)尾的mRNA。例如模板為真核生物來源，Oligo(dT)可與mRNA的3’Poly(A)尾配對，有利于長鏈或全長mRNA的逆轉錄。但是，其對RNA樣品的質量要求較高，不允許其降解，否則全長cDNA合成量會大量減少。

2. 隨機引物

隨機引物是指當特定mRNA由于含有使逆轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體這一不特異的引物來拷貝全長mRNA，一般6到8個堿基，許多隨機引物組成一套引物組。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各種RNA的逆轉錄，對于目標區域具有復雜二級結構/GC含量較高，或者來源為原核生物的模板也同樣適應。

3. 基因特異性引物

基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計的。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。通常特異性引物用于一步RT-qPCR實驗中。

PART 02

逆轉錄引物優劣勢比較

引物類型	結合部位	優點	缺點
Oligo(dT)	真核生物mRNA3’端poly(A)尾	可合成全長cDNA	1、僅擴增有polyA尾的mRNA 2、對模板質量要求高
隨機引物	RNA的許多隨機可結合部位	適合復雜結構和微量模板	特異性低，小片段多
基因特異性引物	特異性互補序列	特異性強，靈敏度高	僅合成特定的序列

PART 03

逆轉錄引物的選擇

RNA類型：

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板

引物選擇：

Oligo(dT)

原因：

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物結合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結合

RNA類型：

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板

2、長度比較長、有二級結構存在及微量樣本的模板

引物選擇：

隨機引物

原因：

隨機引物可以在任意位點和RNA結合并開始反轉

RNA類型：

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加莖環結構的模板

引物選擇：

基因特異性引物

原因：

1、針對特定序列設計的反轉錄引物

2、miRNA（莖環法）的反轉錄，需要根據基因序列設計對應的引物

【注】:為提高反轉錄效率，并保障獲得更加完整的cDNA，建議將Oligo(dT)和隨機引物混合使用。

PART 04

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RNA類型	引物選擇	原因
1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板	Oligo(dT)	1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物結合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結合
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板 2、長度比較長、有二級結構存在及微量樣本的模板	隨機引物	隨機引物可以在任意位點和RNA結合并開始反轉。
1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加莖環結構的模板	基因特異性引物	1、針對特定序列設計的反轉錄引物 2、miRNA（莖環法）的反轉錄，需要根據基因序列設計對應的引物

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